terpenoid

Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa terpenoid antibakteri dari herba meniran (Pyllanthus niruriLinn) dengan metode Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa. Ekstraksi senyawa dilakukan dengan dua cara yaitu maserasi dengan pelarut metanol dan sokletasi dengan pelarut nheksanaa.Hasil uji fitokimia menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard pada ekstrak n–heksanaa hasil maserasi dan ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi menunjukkan bahwa kedua ekstrak tersebut positif mengandung senyawaterpenoid. Hasil uji aktivitas ekstrak n–heksanaa terhadap bakteri Escherichia coli ATCC® 25292 dan Staphylococcus aureus ATCC® 25293 menunjukkan fraksi n–heksanaa hasil sokletasi memberikan daya hambat yang lebih baik. Daya hambat fraksi n–heksanaa hasil maserasi adalah 1 mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 0,5 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus, sedangkan daya hambat fraksi n–heksanaa hasil sokletasi yaitu 10 mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 12 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi dimurnikan dengan menggunakan kromatografi kolom dan diidentifikasi dengan Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa. Data Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa,menunjukkan kemungkinan ekstrak n–heksanaa hasil sokletasi mengandung dua buah senyawa yaitu phytadiene [M+] 278 dan senyawa 1,2-seco-cladiellan m/z 335 [M+- H].

https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:9OfbIhynBssJ:ejournal.unud.ac.id/abstrak/j-kim-vol2-no1-gunawan.pdf+&hl=id&gl=id&pid=bl&srcid=ADGEESjMGS23O-Sry2YFEIm4PdW50FRvoi-GqPfW5_W383iUGau7mSMgVOQgM6l20USwA4kiI_2BlrBj2-0l9x41Z_4u-K5SovCZB3jjiBSczd6wIuOteVc_M2-ud46kTYVx1j33aYNA&sig=AHIEtbQW2GDT4w9mTTBGZIeEPPskKkrT_A

MID SEMESTER (RRA1C110026)

UJIAN MID SEMESTER

Mata Kuliah                            : Kimia Bahan Alam

SKS                                         : 2 SKS

Hari/waktu                              : Kamis, 08 Nopember 2012 pukul 10 s.d 24.00 WIB

Dosen Pengampu                    : Dr. Syamsurizal , M. Si

SOAL

1.      Jelaskan bagaimana hubungan struktur dan kereaktifan beberapa senyawa yang anda kenal terhadap suatu penyakit tertentu.

2.      Uraikan dan berikan contoh dimana letak peran penting suatu metabolisme sekunder dalam suatu tumbuh-tumbuhan

3.      Kemukakan gagasan anda, bagaimana ide suatu senyawa bisa di isolasi dan purifikasi.

4.      Kemukakan bagaimana idenya suatu senyawabahan alam dapat diketahui alur biosintesisnya.

JAWABAN

1). Efedrin merupakan senyawa alkaloid yang dijumpai pada beberapa tanaman genus Ephedra. Di Cina, beberapa Traditional Chinese Medicine seperti ma huang mengandung efedrin dan pseudoefedrin. Produksi efedrin di Cina yang berasal dari tanaman Ephedra sinica cukup besar Namun demikian, efedrin yang dipakai saat ini kebanyakan merupakan senyawa sintetik, karena isolasi dan ekstraksi efedrin dari Ephedra tidak lagi cost-effective karena biaya yang mahal, dan juga ada concern terhadap ketersediaan tanaman Ephedra jika dieksplorasi terus menerus.

 struktur kimia efedrin?
Secara kimia, efedrin menunjukkan isomerisme optikal dan memiliki dua pusat kiral, sehingga menghasilkan 4 stereoisomer Pasangan enantiomer dengan stereokimia (1R, 2S dan 1S,2R) adalah efedrin, sedangkan yang berstereokimia (1R,2R dan 1S, 2S) adalah pseudoefedrin. Isomer yang dipasarkan sebagai efedrin adalah (–)-(1R,2S)-ephedrine. Yang menarik, dengan perbedaan stereokimia ini, efek dari efedrin dan pseudoefedrin berbeda, di mana efedrin memiliki efek yang lebih poten, termasuk juga efek samping yang lebih besar daripada pseudoefedrin. Efedrin dan pseudoefedrin keduanya masih banyak dijumpai dalam komponen obat selesma/obat flu yang ada di pasaran.

Dari struktur kimianya, efedrin merupakan suatu senyawa amina yang memilik struktur kimia mirip dengan turunan metamfetamin dan amfetamin. Dapat dikatakan, efedrin adalah suatu amfetamin yang tersubstitusi dan merupakan analog struktural metamfetamin. Perbedaannya dengan metamfetamin hanyalah adanya struktur hidroksil (OH). Kalian tau amfetamin kan? Amfetamin adalah sejenis stimulan sistem syaraf. Turunannya yaitu metilen dioksi metamfetamin (MDMA) yang sangat ngetop sebagai ecstasy, dan metamfetamin HCl  atau shabu-shabu, merupakan obat yang sering disalahgunakan.

Bagaimana mekanisme aksi efedrin?

Ephedrine adalah amina simpatomimetik yang beraksi sebagai agonis reseptor  adrenergik. Aksi utamanya adalah pada beta-adrenergik reseptor, yang merupakan bagian dari sistem saraf simpatik. Efedrin memiliki dua mekanisme aksi utama. Pertama, efedrin mengaktifkan α-reseptor dan β-reseptor pasca-sinaptik terhadap noradrenalin secara tidak selektif. Kedua, efedrin juga dapat meningkatkan pelepasan dopamin dan serotonin dari ujung saraf.

Dengan mekanisme tersebut, efedrin digunakan untuk beberapa indikasi. Pertama, efedrin dapat digunakan untuk obat asma, sebagai bronkodilator (pelega saluran nafas) karena ia bisa mengaktifkan reseptor beta adrenergik yang ada di saluran nafas. Pengobatan asma tradisional atau jaman dulu masih banyak menggunakan efedrin dalam racikannya, namun obat ini mulai banyak ditinggalkan karena efek sampingnya yang cukup besar. Sifatnya yang tidak selektif di mana dapat mengaktifkan reseptor alfa adrenergik pada pembuluh darah perifer dapat menyebabkan efek vasokonstriksi atau penciutan pembuluh darah, yang bisa berakibat naiknya tekanan darah.

Namun di sisi lain, efeknya sebagai vasokonstriktor ini juga digunakan sebagai mekanisme obat dekongestan (melegakan hidung tersumbat). Diketahui, ketika hidung tersumbat, terjadi pelebaran pembuluh darah pada pembuluh2 kapiler sekitar hidung. Karena itu, efedrin yang bersifat menciutkan pembuluh darah bisa berefek melegakan hidung tersumbat. Hal yang sama terjadi pada pseudo-efedrin. Namun karena pertimbangan keamanan, efedrin sudah jarang dipakai dalam komponen obat flu sebagai pelega hidung tersumbat. Sebaliknya, yang banyak digunakan adalah pseudoefedrin. Mekanisme aksi pseudoefedrin mirip efedrin, tapi aktivitasnya pada beta-adrenergik lebih lemah. Pseudoefedrin menunjukkan selektivitas yang lebih besar untuk reseptor adrenergik alfa yang terdapat pada mukosa hidung dan afinitas rendah pada reseptor adrenergik yang ada di sistem saraf pusat ketimbang  efedrin.

KESIMPULAN NYA

Efedrin menunjukkan isomerisme optikal dan memiliki dua pusat kiral, sehingga menghasilkan 4 stereoisomer Pasangan enantiomer dengan stereokimia (1R, 2S dan 1S,2R) adalah efedrin, sedangkan yang berstereokimia (1R,2R dan 1S, 2S) adalah pseudoefedrin. Isomer yang dipasarkan sebagai efedrin adalah (–)-(1R,2S)-ephedrine. Yang menarik, dengan perbedaan stereokimia ini, efek dari efedrin dan pseudoefedrin berbeda, di mana efedrin memiliki efek yang lebih poten, termasuk juga efek samping yang lebih besar daripada pseudoefedrin Kalau untuk perbedaan kereaktifan tentu saja efedrin lebih reaktif karena mempunyai gugus hidroksil, berbeda dengan amfetamin dan metamfetamin yang tidak mempunyai gugus hidroksil walau bentuk strukturnya sama.sehingga struktur sangat mempengaruhi kereaktifan dari suatu unsur jika salah satu komponen strukturnya diganti atau dihilangkan maka kereaktifannya  akan berubah.

2).

Metabolit sekunder merupakan senyawa yang tidak terlibat langsung dalam pertumbuhan, perkembangan, atau reproduksi makhluk hidup yang fungsinya masih belum diketahui secara pasti. Senyawa ini biasa digunakan untuk pertahanan dan perkembangbiakan tanaman. Kebanyakan senyawa metabolit sekunder ini beracun bagi hewan. Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan biosentesisnya meliputi senyawa alkaloid, fenol, dan terpenoin (Anonim, 2010).

Kurkumin merupakan salah satu produk senyawa metabolit sekunder dari tanaman Zingiberaceae, khusunya kunyit dan temulawak yang telah dimanfaatkan dalam industry farmasi, makanan, farfum dan lain-lain (Joe et al. 2004). Senyawa kurkumin ini, seperti halnya senyawa kimia lain seperti antibiotic, alkaloid, steroid, minyak atsiri, resin, fenol yang merupakan hasil dari metabolit sekunder suatu tanaman (Indrayanto, 1987). 

Kurkominoid adalah sekelompok senyawa fenolik yang terkandung dalam rimpang tanaman family Zingiberaceae antara lain: Curcuma longa syn. Curcuma domestica (kunyit) dan Curcuma xanthorhiza (temulawak). Kurkumanoid bermanfaat untuk mencegah timbulnya infksi berbagai penyakit. Kandungan utama dari kurkumanoid adalah kurkumin yang berwarna kuning. Kandungan kurkumin di dalam kunyit berkisar 3-4% (Joe et al, 2004; Eigner dan Schulz, 1999). Kurkumin (C2H20O6) atau diferuloyl methane pertama kali diisolasi pada tahun 1815. Kemudian tahun 1910, kurkumin diperoleh dalam bentuk Kristal dan dapat dilarutkan pada tahun 1913. Kurkumin tidak dapat larut dalam air tetapi dapat larut dalam etanol dan aceton (Joe et al, 2004; Chattopadhyay et al, 2004; Araujo). 

Metabolit sekunder seperti kurkumin dari tanaman kunyit dan temulawak dapat dibentuk dengan cara menginduksi jaringan tanaman pada media yang mengandung zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus. Kalus berasal dari potongan organ yang telah steril dalam media yang telah mengadung auksin dan kadangkala sitokinin. Kalus selanjutnya diperbanyak dengan cara kultur kalus ataupun suspensi dan dapat juga menggunakan elisitor dalam fermentor atau bioreactor, contohnya ginseng (Furaya, 1982). 

Senyawa metabolit sekunder melalui kultur jaringan dapat diisolasi dari kalus atau sel. Kandungannya dapat ditingkatkan melalui seleksi bahan tanaman atau jaringan, tingkat pertumbuhan tanaman, pemakaian zat pengatur tumbuh dan prekusor, pemakaian mutagen baik secara fisik maupun kimia serta manipulasi faktor lingkungan. Kalus sebagai bahan senyawa sekunder dan produk lainnya dapat dipacu pembentukan dan pertumbuhannya dengan pemakaian zat pengatur tumbuh 2,4D, NAA, dan sering pula direkombinasikan dengan sitokinin. Adakalanya, kombinasi auksin dengan sitokinin selain slain dapat merangsang proses pembelahan sel juga mempengaruhi kandungan senyawa sekundernya. Hasil penelitian Staba (1976) mendapatkan peningkatan kandungan diosgenin dengan penggunaan 2,4D pada tanaman Dioscarea deltoidea. 

Pada kultur sel, kalus akan kehabisan hara yang disebabkan karna masa kultur yang panjang yang mengakibatkan penguapan air dan unsur hara dari waktu ke waktu. Selain kehabisan hara, sel-sel dalam kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan hasil metabolit sekunder. Sehingga akan menghasilkan senyawa kurkumin dalam jumlah besar dalamwaktu singkat (Kristina, 1992). 

Keberhasilan sintesa metabolit sekunder dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan kendala biologis. Faktor lingkungan dapat meliputi cahaya, penggunaan zat pengatur tumbuh, prekusor, unsur hara yang tersedia, komposisi medium, perbedaan morfologi, jaringan tanaman yang digunakan dan aktivitas biosintesa(Tabata dalam Dalimuthe, 1987). Bahan aktif dari suatub tanaman ini, dapat diperoleh dari tanaman lengkap. Tanaman berinteraksi dengan lingkungan memperoleh metabolit sekunder yang bermacam-macam (Harborne, 1996). 

Seleksi in vitro untuk mendaparkan kalus dari tanaman kunyit dan temulawak yang mengandung kurkumin tinggi dapat dilakukan dengan menggunakan agen seleksi filtrate atau elisitor yang ditambahkan ke dalam media tumbuh. Agen seleksi filtrat adalah jasad renik atau bagaian dari gen-gen jasad renik yang mampu menampung gen asing yang ditumpangkan pada struktur jasad renik tersebut dan ditransplantasikan ke dalam sel-sel yang diharapkan mampu mengubah sifat-sifat sel (Xiaojie et al, 2005). 

KESIMPULAN 

Metabolit sekunder adalah senyawa yang tidak terlibat langsung dalam pertumbuhan, perkembangan, dan reproduksi makhluk hidup. Metabolit sekunder memegang peranan penting sebagai system pertahanan terhadap virus (bakteri dan fungi), herbivore (molusca, anthropoda dan vertebrata), tanaman lain (melalui allelopati), sebagai atractan bagi binatang membantu polinasi dan penyerbukan, penyimpanan nitrogen, system transport nitrogen dan proteksi terhadap sinar UV. 

Senyawa metabolit sekunder dari tanaman kunyit dan temulawak berada pada rimpangnya. Salah satu kandungannya metabolit sekunder yaitu kurkumin sebanyak 3-4%. Kurkumoanoid merupakan senyawa fenolik yang bermanfaat untuk mencegah timbulnya infeksi berbagai penyakit. 

Peningkatan kadar kurkumin pada tanaman ini dapat dilakuakn melalui metode bioteknologi yaitu kultur jaringan. Bahan eksplan yang digunakan berasal dari organ tanaman untuk membentuk kalus, yang selanjutnya kalus diperbanyak dengan suspensi. Selain itu, dapat pula digunakan lisitor dalam fermentor atau bioraktor dan menggunakan agen seleksi filtrat.

3). Suatu senyawa dapat di isolasi dan di purifikasi Langkah pertama yang di lakukan adalah melakukan identifikasi simplisa yaitu mencari tahu senyawa apa yang ada di dalam tumbuhan tersebut, contohnya uji flavonoid, alkaloid, steroid, terpenoid, dan fenolik.

Setelah kita mengetahui senyawa apa yang terkandung di dalam tumbuhan tersebut maka kita harus memilih pelarut yang sesuai dengan senyawa tersebut dengan syarat:

·         Pelarut yang mudah menguap Contoh : heksan, eter, petroleum eter, metil klorida dan alkohol.

·         Pelarut tidak melarutkan senyawa yang di inginkan.

·         Titik didih pelarut rendah.

·         Pelarut terbaik untuk bahan yang akan diekstraksi.

·         Pelarut tersebut akan terpisah dengan cepat setelah pengocokan.

·         Sifat sesuai dengan senyawa yang akan diisolasi, polar atau nonpolar.

Syarat-syarat sampel yang digunakan dalam proses sokletasi yaitu :
1.    Sampel yang digunakan mempunyai pori-porinya harus lebih besar
Contonya tea,
2.    Sampel yang digunakan tidak dapat dilarutkan oleh pelarut yang digunakan
3.    Sampel yang digunakan mudah ditembus oleh pelarut

a). isolasi

Isolasi dan Pemurnian Senyawa Antibakteri Pemisahan komponen–komponen yang terdapat di dalam fraksi dilakukan dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji KLT dilakukan dengan cara berbagai perbandingan pelarut, mulai dari pelarut yang non polar hingga pelarut yang bersifat polar. Uji KLT ini dilakukan untuk tujuan Kualitatif. Pemisahan dalam jumlah besar digunakan Kromatografi Kolom, lalu dielusi dengan pelarut organik dengan meningkatkan kepolarannya secara bertahap, dapat tunggal atau kombinasi. Sedangkan pemurnian dilakukan dengan rekristalisasi, yaitu berdasarkan kemampuan melarutkan zat yang dimurnikan. Proses rekristalisasi diulang beberapa kali sehingga didapatkan senyawa yang berbentuk kristal.

Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi Karakterisasi senyawa hasil isolasi meliputi pemeriksaan organoleptis, sifat kimia, fisika dan sifat fisikokimia. Pemeriksaan organoleptis dilaukan secara visual yang meliputi pengamatan warna dan bentuk dari senyawa hasil isolasi. Pemeriksaan sifat fisika meliputi sifat kelarutan dan jarak titik leleh. Pemeriksaan fisiko kimia dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS, spektrofotometer Inframerah dan NMR

b). Purifikasi

Proses purifikasi adalah metode untuk mendapatkan komponen bahan alam murni bebas dari komponen kimia lain yang tidak dibutuhkan. Untuk tingkatan kemurnian (purity)  suatu struktur senyawa tertentu, kemurnian bahan harus 95-100% . Sedangkan ekstrak terpurifikasi harus dijelaskan bahwa ekstrak terpurifikasi dari komponen apa sehingga tidak menimbulkan multipersepsi. Komponen kimia dalam ekstrak yang tidak dibutuhkan seperti lipid, pigmen (klorofil), tanin, plastisiser, dan pelumas yang dapat berasal dari alat.

Penggunaan ekstrak terpurifikasi adalah alternatif untuk meminimalkan massa suatu ekstrak dalam tujuan praktis pembuatan sediaan secara farmasetis karena beberapa komponen yang terkandung dapat direduksi dengan proses tersebut. Hal ini juga untuk menjaga beberapa kandungan kimia ekstrak yang berefek sinergisme sehingga dapat memaksimalkan proses pengobatan karena dalam beberapa kasus, komponen kimia yang telah diisolasi justru menunjukkan penurunan efek.

4). Penetapan Urutan Biosintesis

Metoda  utama dari penetapan suatu urutan biosintesis adalah penggunaan pengusut isotopik. Jika kita percaya bahwa unsur A, sebagai contoh glukosa 6- fosfat, dapat dirubah oleh sel hidup menjadi unsur B, sebagai contoh fruktosa 6-fosfat, yaitu bahwa A menjadi B, kita bisa berharap untuk menetapkan ini dengan memperkenalkan A ke dalam beberapa sel  yang berisi atom bertanda, dan bisa diidentifikasi karena walaupun mereka memiliki massa yang berbeda  atau radioaktifitas yang berbeda  namun secara kimiawi mereka hampir serupa. Sebagai contoh, kita mungkin mengetahui dalam sel glukosa 6-fosfat  berisi ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁸O, atau ³²P. jika, setelah beberapa waktu, fruktosa 6-fosfat terisolasi dari sel dan ditemukan berisi atom bertanda, kita dapat menyimpulkan bahwa sel tersebut mungkin dapat mengkonversi glukosa 6-fosfat menjadi fruktosa 6-fosfat. Jika kita mengetahui posisi atom bertanda dalam kedua unsur tersebut  kita dapat memperoleh informasi lebih lanjut  tentang detil conversi tersebut.

Ada beberapa kesulitan dalam penggunaan prosedur ini, tanda label harus disatukan dengan label-label yang ditunjukan letak dan jumlah label pada setiap posisi pembuatan. Tandanya harus diketahui pada organisme hidup, sebut saja tumbuhan. Hal ini tidak biasanya menjadi sebuah kemungkinan untuk mengenal sel secara langsung dimana hal ini dapat digunakan. Dan praktek umum dengan tanaman atau jamur dapat ditumbuhkan pada kandungan atmosfer contohnya CO₂ atau kandungan pelarut contonya CH₃COONa. Sebagai kemungkinan, sebuah pelarut dari tanda mungkin diikuti agar dapat menapis sebuah sumbuh dilewati sampai sebuah batang atau benih kelopak.

Bagaimanapun, pemberian makanan senyawa agar lengkap seperti tanaman mungkin tidak pernah diadsorbsi oleh tanaman, mukin tidak pernah di traspor ke bagian tanaman dimana dimana sintesis produk akhir pada pembelajaran yang didapatkan atau mungkin sama sekali diturunkan enzim baru lainnya utnuk memberikan bagian-bagian terkecil yang tak bernilai. Sintesis produk menurut studi mungkin terjadi hanya pada waktu yang pasti dalam 1 tahun, membuat eksperimen pemberian makanan di lain waktu tak berguna. Masalah lain dengan organisme  utuh adalah tentang label bahan makanan dicairkan dengan kolam tak berlabel dari bahan itu sudah dibarukan pada sel-sel dan dengan beberapa bahan diproduksi contohnya dalam fotosintesis, selama periode dari eksperimen.

Untuk menghindari beberapa masalah, mungkin diperlukan lankah-langkah untuk dikerjakan dengan isolasi organ atau jaringan, atau dengan pemeliharaan dari suatu pasangan  sel, atau lebih baik, isolasi berasal dari larutan yang konsentrasinya tinggi didalam enzim dan co-faktor yang dibutuhkan untuk studi reaksi biosintesis. Sumber yang paling baik untuk digunakan dalam reaksi biosintesis yakni  dengan menggunakan larutan yang hanya mengandung enzim murni, co-faktor, dan permukaan material.

Penggabungan dari labeled mencapai tanda, produk harus diisolasi, banyaknya jumlah dari pemberian tanda didalamnya menentukan jumlah dari keseluruhan molekul, dan lokasi yang sama dari tanda. Tandanya adalah ¹³C, ini dapat menjelaskan spectrum NMR dan campuran senyawa dari ¹³C dengan beberapa atom hydrogen yang berdekatan. Jika tandanya tidak sama/berbeda  massa e,g ¹³C atau ²H, posisinya dijelaskan oleh teori pecahan atom menjadi spectrum massa dari beberapa zat kimia. Sebagian besar metode yang digunakan yakni radioaktif, ¹⁴C dan ³H. Untuk mendapatkan tanda tersebut molekul harus didegradasi secara spesifik untuk mendapatkan produk murni dari proses radioaktif berdasrkan ukurannya. Ini memerlukan pengetahuan tentang ilmu kimia serta bahan campuran senyawa, jadi isolasi dari atom secara spesifik dapat dilakukan.

Teknik ini dilakukan dengan pemberian tanda awal untuk menyusun atau membuat hubungan antra reaksi awal dan produk. Reaksi awal …oleh percobaan dan kesalahan, atau oleh intuisi. Eksperimen harus dilakukan untuk setiap tanda. Kegagalan dalam  mencapai penggabungan mungkin diakibatkan dari kesalahan absorbs atau dari transport, dapat dilihatan dari tanda produk, sebenarnya tidak membuktikan adanya konfeksi, saat itu  materi mengalami modifikasi atau tetap utuh sebelum atom tergabung. Pencaharian sebelumnya menemukan atau mungkin mendeteksi tanda yang lebih banyak dengan dua atau lebih tanda. Tidak sama dua bahan e.g. ¹⁴C, ²H, dan ¹⁵N, didalam tidak sama bagian molekul. Perbandingan dari jumlah setiap tanda adalah sama didalam reaksi dan produk, molekul kiranya memasukan lebih/ tidak banyak dalam keadaan utuh. Larutan sederhana seperti asam cuka yang kompleks dapat membuat tanda yang sangat luas. Dari produk dimana hanya mengubah hasil produk, kemungkinan menghasilkan tanda sangat kecil, mungkin tidak lebih banyak dari 0,01%. Reaksi kompleks dapat diubah dalam produk akhir, dalam golongan kecil langkan biasanya memiliki golongan kecil mungkin  alternative dan presentasi dari penggabungan dalam produk merupakan studi awal.

Teknik kedua yang terpenting didalam menentukan biosintesikntesis, yakni membuat urutan berupa nomor dari produk yang diketahui bentuknya. Sebagai contoh zat A, B, dan C merupakan bagian dari biosintesis. Urutannya A→B→C, dan tanda A adalah fed, tanda yang akan muncul pertama adalah B dan yang berikunya adalah C, dan urutan ini dapat diperiksa saat isolasi  B dan C, keduanya sebelumnya memiliki panjang waktunya berbeda dan jumlah tanda didalam setiap tanda.

Metode yang ketiga, dengan adanya keuntungan dari system yang tidak normal diman satu tahap dalam biosintesia tehalangi. Reaksi kimia didalam sel oleh protein kompleks , menggumakan enzim. Umunya satu enzim digunakan untuk setiap rekasi atau untuk sekelompok kecil beberapa reaksi yang saling berhubungan. Enzim adalah suatu zat yang bekerja secara spesifik. Jika tidak ada bantuan dari enzim, reaksi dengan katalis tidak akan terjadi. Jika reaksinya normal maka urutan dari sintesisnya yakni, mulanya zat akan terakumulasi atau digunakan untuk sesuatu yang lain, dan komponen yang terakhir didalam urutan tidak akan terbentuk. Ini sangat mungkin untuk organisme yang normal dan bereproduksi, meskipun mengalami kekurangan enzim didalam varietasnya, walaupun mengalami kekurangan tidak mencegah proses sintesis zat-zat kimia yang esensial. Hal seperti itu merupakan varietas tiruan dari organism dan disebut ‘mutan’. Mutan dari bakteri atau fungi timbul secara alami atau dapat dibuat, untuk contoh penyinaran  untuk varietas normal denga sinar ultraviolet. Hal ini merupakan bagian terbesar dari ilmu organism dari metode ini. Produk organism yang normal, produk D merupakan mutan dari organism bukan merupakan produk, ini sangat kuat untuk menghalangi reaksi biosintesis A→B→C→D dari tingkatan B→C mengalami kekurangan akan kebutuhan enzim. B akan terakumulasi atau mengalihkan beberapa produk zat kimia baru, atau kembali  ke A. C dan D akan terlepas, tapi jika C menyadiakan dari bagian luarnya, maka akan masuk ke dalam D. Dari hasil penelitian mengapa tidak sama produk yang terakumulasi didalam mutan, atau mengapa produk harus ditambah untuk memperbaiki sintesis dari ‘missing’ produk itu mungkin untuk membuat biosintetik atau untuk menemukan hal yang tidak diketahui tingkatannya didalam urutan.